生物潔凈室無菌工藝試驗

生物潔凈室無菌工藝模擬試驗是采用微生物培養基代替產品對無菌工藝進行評估的驗證技術。無菌工藝模擬試驗也被稱為培養基灌裝或培養基灌裝試驗，通常需要將培養基暴露于設備、容器密封系統的表面和關鍵環境條件中，并模擬實際生產完成工藝操作。然后將裝有培養基的密封容器進行培養以檢查微生物的生長，并對結果進行評價，以確定實際生產中產品被污染的概率。

培養基灌裝試驗需要模擬整個工藝過程，包括從部件、材料的滅菌準備，配制混合，無菌過濾，灌裝，一直到完成容器密封的整個過程。培養基灌裝是用于評估整個無菌工藝過程，用以表明如果嚴格按照工藝要求生產，產品的無菌性有可靠保證；但須承認，不管模擬試驗還是實際生產總是存在差異的，因此不能將培養基灌裝結果與實際生產中的污染概率等同起來，即使獲得很好的培養基灌裝結果，也不能排除實際生產發生污染的可能性。

培養基灌裝應在實際生產相同的條件(環境、設備等)下盡量模擬實際生產完成操作。應充分考慮生產時可能造成污染的各種因素，應對常規生產中的各種干擾活動進行模擬，應模擬常規生產可能遇到的較差條件狀況下的操作。

1. 生物潔凈室培養基灌裝技術

培養基的選擇和處理，培養基灌裝試驗頻率，生產線較長允許運行時間(長時間生產可能導致污染增加)，班次更換、暫停及必要的更衣，灌裝批次量，生產線的運行速度及設置，實際生產可能出現的正常干擾次數、類型及復雜程度，以及非常規的干擾和活動(如設備維修、中斷、設備的各種調整)，環境監測方案和取樣操作，關鍵區域內較多可容納的總人數及人員可能的活動，容器的密封系統(如規格、大小、類型、對設備的兼容性)，無菌條件下的運輸、轉移次數(如容器轉移、加膠塞、加無菌原輔材料)，只有經過培養基灌裝的人員才能參與實際無菌生產，培養基灌裝后應隨即對生產設施和設備清洗和滅菌，避免殘留培養基造成污染。

2. 生物潔凈室培養基灌裝培養基的選擇

胰酪大豆胨液體培養基(TSB) 是一種廣譜性培養基，特別對無菌工藝環境中源自人體的細菌、芽孢和真菌有良好的促生長效果，是無菌工藝模擬試驗常用的培養基。如果產品需充入惰性氣體、儲存在無氧條件，無菌操作在嚴格的厭氧環境(即氧氣濃度低于0.1%)中進行時，應評估是否采用厭氧培養基。在厭氧的無菌工藝環境監控中反復發現厭氧微生物或在產品無菌檢查中發現厭氧微生物時，需評估增加厭氧培養基。用于模擬抑菌性產品的培養基，如有必要需評估抑菌性產品對其促生長能力及模擬試驗結果的影響。促生長試驗的指示菌除了相關規定以外，還應考慮使用環境監控和無菌檢查中的分離菌，以代表實際生產中的可能遇到的污染菌，促菌生長試驗的接種量應不超過100CFU。

3. 生物潔凈室培養基灌裝運行試驗次數及頻率

新建無菌生產線，在正式投產之前，每班次應當連續進行3次合格的模擬試驗。正常生產期間應當按照每條生產線每班次每半年進行一次試驗， 每次至少一批。 對于因其他原因停產一定周期的生產線，在恢復正式生產前應進行無菌工藝模擬試驗。如是再驗證，日常生產中，針對微生物污染事件而制定了糾正措施，在模擬試驗時，可對糾正措施的有效性給予確認。若空氣凈化系統、生產用設備、無菌生產工藝及人員有重大變更，或設備有重大維修后，應評估確定無菌工藝模擬再試驗的批次數，充分評估生產線的風險。在發現設施、人員、環境或工藝的持續監測出現不良趨勢或無菌不合格時，也應考慮再次進行模擬試驗。

4. 生物潔凈室培養基灌裝數量及模擬持續時間

無菌工藝模擬灌裝數量應足以保證評價的有效性及完成模擬方案中設計的各種干預活動。應通過評估對所設計的灌裝數量、持續時間、模擬方式、預期收率作出合理說明。

生產批量小于5000支，模擬灌裝批量應至少與生產批量相同；產品的生產批量在5000~10000支，模擬灌裝數量應與產品實際的生產批量相當；大規模生產，即產品的生產批量大于10000支，較低模擬灌裝數量應不得低于10000支；對于超大批量的生產規模，如大于100000支，則應考慮適當增加模擬的灌裝數量；如采用密封性生產設備，可適當降低模擬數量。

5. 生物潔凈室培養基灌裝運行速度

培養基灌裝試驗方案應闡明生產線運行的速度范圍，每次運行試驗中，應對單一生產線的速度作出評估并說明鎖定速度的理由。比如大敞口容器的低速運行一般適用于評估無菌產品、 容器、膠塞在無菌區暴露時間比較長的工藝，高速運行則比較適用于評估那些存在大量手工干擾的生產工藝。

6. 生物潔凈室培養基灌裝容器裝量

容器中培養基灌裝體積應考慮適宜微生物生長的需要和容器內表面覆蓋的要求。灌裝體積不必與產品相同，但合適的灌裝量既應保證產品通過倒置和旋轉接觸到所有內表面并有足夠的氧氣支持微生物的生長，又應利于對培養基的觀察。

7. 生物潔凈室培養基灌裝干預設計

干預是由操作人員按照相關規定參與無菌工藝生產的所有操作活動。干預可分為固有干預和糾正性干預。固有干預是指常規和有計劃的無菌操作，如裝載膠塞、 環境監控、設備安裝、部件組裝等；糾正性干預是對無菌生產過程的糾正或調整，如生產過程中清除破碎的瓶子、排除卡住的膠塞、更換部件、設備故障排除等。中凈環球凈化可提供生物潔凈室、無菌室的咨詢、規劃、設計、施工、安裝改造等配套服務。

無菌模擬試驗方案中應明確規定固有干預和糾正性干預的頻次、類型及復雜程度，如倒瓶剔除等進行簡單干預；灌裝機泵及針頭裝配、設備故障維修等進行復雜干預。固有干預及經常發生的糾正性干預一般應在每次模擬中都實施，偶發性的干預可周期性地模擬，如無菌生產過程意外暫停或重啟，無菌狀態下設備、設施偶發故障排除等。

模擬試驗應設計并實施足夠數量的糾正性干預，干預頻次的設計應考慮實際生產情況，按比例覆蓋模擬試驗的全過程。對于無菌取樣、調整裝量過程，均應考慮在分裝的前、中、后階段進行。

實施干預的人員(應包括操作、維修人員等)應經過相關的培訓和考核，并能按規定的程序實施各種干預。標準化的、簡單的固有干預可由部分操作人員實施并據此評價其他人；對于復雜操作，如裝配灌裝機等，每個從事該操作的人員都應在驗證過程中模擬，操作條件不應優于日常生產的操作條件。

8. 生物潔凈室 干預后產品(容器)的處理

實際工藝中如明確規定受干預影響的產品(容器) 應從生產線上剔除，在模擬試驗時也可剔除；模擬試驗時產生的這類產品(容器)可不培養，但不培養的容器應予以記錄并評估其合理性；如在干預發生前已經密封，在日常生產中按規定不需要剔除的產品，模擬試驗時也應保留、培養并納入評估。

模擬試驗過程中的所有干預須記錄，糾正性干預記錄的內容至少應包括糾正性干預的類型、位置、次數；固有干預記錄至少包括干預內容和發生頻率。

9. 生物潔凈室環境條件及監測

培養基灌裝試驗的環境條件應充分體現生產操作的實際情況，不應該采取特別的生產控制和預防措施，制造特別良好的工藝環境，這樣會導致不準確的評估結論，造成工藝條件良好的假象。需要注意的是，不應當人工創造極端的環境條件(如對凈化空調重新調整，使其在較差的狀態下運行)進行驗證，對于環境較差條件的挑戰應當是在工藝允許的苛刻條件范圍內對環境受干擾程度(如生產現場人員較多、生產活動頻率較高)的挑戰。

在培養基灌裝過程中也應當進行環境監測，環境監測的方案可以與日常監控不同，但監測要求不能低于日常生產。

10.人員培訓

所有被授權在生產時進入無菌區的人員，包括觀察人員和維修人員，每年至少應參加一次培養基灌裝試驗。所有實際生產中將在關鍵區域進行操作的人員都應該參加每次的培養基灌裝，參與人員應按照常規生產的職責模擬與其相關的活動。

在培養基灌裝前須準備好方案和相關文件，應對人員職責進行方案說明，比如監督和觀察職責如何實施；所有參與培養基灌裝的人員應當經過適當培訓以保證他們對方案和實際實施有足夠的了解。

11.容器/密封件規格及切換

有些情況下同一生產線可能用于不同大小容器的灌裝。一般來說培養基灌裝可以針對規格較大和規格較小的容器進行，除非其他不同規格容器的灌裝工藝有很大差別，在初始驗證時可以進行兩次大規格容器和一次較小規格容器的灌裝挑戰；在以后的周期性半年度灌裝可以輪換，每次挑戰一種規格，對于生產線切換不同規格產品的操作會增加污染，因此在驗證時也要挑戰切換操作。

12. 容器/密封件系統的完整性測試

無菌容器/密封件系統的完整性測試可以在培養基灌裝時進行，可以采用微生物侵入試驗來評價密封完整性，即將灌裝了無菌培養基的容器按照實際生產的流程進行密封后置于濃度不低于10⁶CFU/ml的菌懸液中，然后進行培養檢查以評估系統的完整性。

13. 生物潔凈室培養基灌裝培養與檢查

①培養條件：應對容器進行翻轉、倒置等，確保培養基接觸容器( 包括密封件)的所有內表面，培養時間至少14天；可選擇兩個溫度進行培養：在20~25℃培養至少7天，然后在30~35℃培養至少7天；如選擇其他培養計劃，應有實驗數據支持所選培養條件的適用性，在整個培養期間應連續監控培養溫度。

②培養結束后，應對所有模擬灌裝產品逐一進行無菌性檢查，通常應在合適的照度下進行目視觀察。在培養期間定期觀察培養基的培養情況，如在培養期間發現異常情況時應進行進一步調查； 如在檢查中發現密封缺陷的灌裝產品，應進行適當的原因調查并采取糾正措施。

③計數與數量平衡：為保證模擬試驗結果的可靠性，應對各階段灌裝數量進行準確計數，如灌裝數量、干預剔除數量、培養前和培養后無菌檢查數量，各階段數量應平衡。如發現不平衡，應調查原因并判斷本次模擬試驗結果的有效性。

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